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    人活化素A(ACV-A)ELISA試劑盒使用說明書

    發(fā)布時間: 2016-02-01  點擊次數(shù): 1463次

     人活化素A(ACV-A)ELISA試劑盒實驗原理
    用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗ACV-A抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗ACV-A抗體、HRP標記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的ACV-A呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。 
    試劑盒組成及試劑配制 
    1. 酶聯(lián)板(Assay plate ):一塊(96孔)。 
    2. 標準品(Standard):2瓶(凍干品)。
    3. 樣品稀釋液(Sample Diluent):1×20ml/瓶。
    4. 生物素標記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent):1×10ml/瓶。
    5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 (HRP-avidin Diluent):1×10ml/瓶。
    6. 生物素標記抗體(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1:100)
    7. 辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1:100)
    8. 底物溶液(TMB Substrate):1×10ml/瓶。 
    9. 濃洗滌液(Wash Buffer):1×20ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
    10. 終止液(Stop Solution):1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
    需要而未提供的試劑和器材
    1. 標準規(guī)格酶標儀
    2. 高速離心機
    3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
    4. 干凈的試管和Eppendof管
    5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,一次檢測樣品較多時,用多通道移液器
    6. 蒸餾水,容量瓶等
     人活化素A(ACV-A)ELISA試劑盒操作步驟
    實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?,試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
    1. 加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?00μl,余孔分別加標準品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應120分鐘。
    為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
    2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl(取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制),37℃,60分鐘。
    3. 溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,200μl/每孔,甩干。 
    4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(同生物素標記抗體工作液) 100μl,37℃,60分鐘。
    5. 溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,200μl/每孔,甩干。
    6. 依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔顯色不明顯,即可終止)。
    7. 依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn))。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,底物反應時間到后應盡快加入終止液。
    8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

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